ラットY染色体FISHプローブ
FISHプロトコル
試薬
- FISHプローブ
- ホルムアミド
- エタノール
- パラホルムアルデヒド
- ペプシン
切片の前処理
(凍結切片)
- 切片を室温に戻し、氷冷4%PFA/PBSで30分固定 PBSで十分に洗浄
- 0.02%〜0.5%ペプシン/0.1N塩酸溶液中で37℃、1分〜30分反応
- PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥
(パラフィン包埋切片)
- 脱パラ
- 2×SSC中5分浸漬
- 2×SSC中、10分間電子レンジで加熱
- PBS中で放冷 0.02%〜0.5%ペプシン/0.1N塩酸溶液中で37℃、1分〜30分反応
- PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥
ハイブリダイゼーション
- 切片にプローブをアプライしカバーグラスをかける
- 凍結切片80℃、パラフィン切片80〜90℃のホットプレート上で10分間加熱し変性処理する
- 湿潤箱で37℃でovernightハイブリダイズさせる
洗浄・検出(ダイレクト蛍光標識プローブ)
- 2×SSC中5分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
- 50%ホルムアミド/2×SSC中、46℃、20分浸漬(バックグランドが出る場合は50℃まで可)
- 1×SSC中15分浸漬
- DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
- 蛍光観察
洗浄・検出(ハプテン標識プローブ)
- 2×SSC中5分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
- 50%ホルムアミド/2×SSC中、46℃、20分浸漬(バックグランドが出る場合は50℃まで可)
- 1×SSC中15分浸漬
- Blocking溶液にて30分間Blocking(5% milkまたは1% BSA in 4×SSCなど )
- 蛍光標識avidinもしくは蛍光標識streptavidin /blocking溶液で30分〜1時間反応
- 0.1% Nonidet P-40 (0.05% Tween20)/4×SSCで10分×2回、4×SSCで10分×1回洗浄
- DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
- 蛍光観察