染色体解析・FISH解析/有限会社クロモソームサイエンスラボ
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ラットY染色体FISHプローブ FISHプロトコル

<試薬>
FISHプローブ
ホルムアミド
エタノール
パラホルムアルデヒド
ペプシン

<切片の前処理>
(凍結切片)
1.切片を室温に戻し、氷冷4%PFA/PBSで30分固定 PBSで十分に洗浄
2.0.02%〜0.5%ペプシン/0.1N塩酸溶液中で37℃、1分〜30分反応
3.PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥
(パラフィン包埋切片)
1.脱パラ
2.2×SSC中5分浸漬
3.2×SSC中、10分間電子レンジで加熱
4.PBS中で放冷 0.02%〜0.5%ペプシン/0.1N塩酸溶液中で37℃、1分〜30分反応
5.PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥

<ハイブリダイゼーション> 
6.切片にプローブをアプライしカバーグラスをかける
7.凍結切片80℃、パラフィン切片80〜90℃のホットプレート上で10分間加熱し変性処理する
8.湿潤箱で37℃でovernightハイブリダイズさせる

<洗浄・検出(ダイレクト蛍光標識プローブ)>
9.2×SSC中5分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
10.50%ホルムアミド/2×SSC中、46℃、20分浸漬(バックグランドが出る場合は50℃まで可)
11.1×SSC中15分浸漬
12.DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
13.蛍光観察

<洗浄・検出(ハプテン標識プローブ)>
9.2×SSC中5分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
10.50%ホルムアミド/2×SSC中、46℃、20分浸漬(バックグランドが出る場合は50℃まで可)
11.1×SSC中15分浸漬
12.Blocking溶液にて30分間Blocking(5% milkまたは1% BSA in 4×SSCなど )
13.蛍光標識avidinもしくは蛍光標識streptavidin /blocking溶液で30分〜1時間反応
14.0.1% Nonidet P-40 (0.05% Tween20)/4×SSCで10分×2回、4×SSCで10分×1回洗浄
15.DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
16.蛍光観察

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